所有作者：朱立明 童富淡 刘俊 吕正兵 聂作明 陈健 于威 张耀洲
作者单位：浙江理工大学生物化学研究所
论文摘要：从家蚕蛹的cDNA文库中筛选得到一条含有TRAPα保守结构域的cDNA，并将其命名为BmTRAPα（Bombyx translocon associated protein alpha），GenBank登陆号为DQ３１１４１３。该基因序列长为１３８９ bp，ORF是８４０ bp，编码２７９个氨基酸残基，预测分子量为３０。８ kD。我们将扩增到的BmTRAPα基因克隆到融合表达载体pET-２８a相应的酶切位点上，得到融合蛋白表达质粒pET-２８a-BmTRAPα，经PCR和酶切鉴定证明重组子正确，将该重组子转化大肠杆菌BL２１(DE３)，用终浓度为１ mM的IPTG诱导重组菌后，收集菌体并制样，SDS-PAGE分析表明，在Marker大小３５ kD附近有一条特异性蛋白条带，与预期值相符（融合标签３。５６ kD，BmTRAPα是３０。８ kD）。通过镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白，并用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，用Protein A凝胶柱纯化多克隆抗体，ELISA检测效价大于１：１２８００。提取家蚕各时期和五龄幼虫各组织的总蛋白，用于Western blot实验测定BmTRAPα在各时期和五龄期各组织的含量。Western blot结果表明，BmTRAPα蛋白在家蚕的蛹期表达量最高，五龄期的生殖腺、丝腺、马氏管和脂肪体均有表达，丝腺和脂肪体中表达量较高，而在血淋巴中没有检测明显的信号。我们还利用荧光定量PCR的方法，对家蚕卵、五龄幼虫、蛹和蛾的发育时期，以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量进行比较，转录水平与翻译水平存在一定差异。以家蚕BmN细胞进行免疫细胞化学实验，结果显示，在整个细胞周期，BmTRAPα蛋白均主要分布在细胞质中。
关键词： 家蚕 TRAPα 荧光定量 组织定位 亚细胞定位
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