所有作者：刘广强 全滟平 张耀洲
作者单位：浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所
论文摘要：Ras 基因是一类重要的原癌基因，从裂殖酵母到人类等高等动物普遍存在。Ras蛋白是一种小G蛋白，在各种信号分子的作用下，对细胞的生长、增殖进行调控。Bombyx mori ras oncoprotein（Bras１）含有一个H-N-K-Ras-like保守结构域，是Ras超家族在昆虫中的一个成员。从本实验室家蚕基因库中筛选得到Bras１基因的cDNA序列，GenBank登录号为NM_００１０４３５０８。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明：Bras１的mRNA序列全长１４５９ bp，含有１个５７９ bp的开放阅读框（ORF），编码１９２个氨基酸残基。构建含有Bras１片段的pET-２８a的重组质粒；将鉴定正确的pET-２８a重组质粒转入感受态BL２１（DE３）中，筛选阳性克隆，诱导工程菌表达目的蛋白；用Ni柱亲和层析纯化后得到纯的融合Bras１蛋白；透析复性后的融合蛋白用铁钼法测定其水解GTP的能力，试验结果表明本实验纯化的融合Bras１蛋白具有水解GTP的能力，有一定的GTP酶活性。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫雄性新西兰大白兔制备多克隆抗体，ELISA检测多克隆抗体的效价可达到１：６４００以上。提取家蚕各时期和五龄幼虫各组织的蛋白，用Western blot检测Bras１在各组织的表达情况。结果表明：Bras１在头部、丝腺、马氏管和生殖腺中存在表达；在各个发育时期，卵，蛹，蛾的表达量都很高，幼虫中较少。亚细胞定位结果表明，该蛋白主要存在于细胞质中，其中一部分和细胞膜结合；在用美伐他汀干扰Bras１蛋白的膜结合能力后，发现Bras１与膜的结合能力对家蚕BmN细胞的增殖有一定影响。研究结果为进一步探讨家蚕Bras１蛋白的相关功能奠定了基础。
关键词： 家蚕Ras oncoprotein GTPase活性 组织定位 亚细胞定位 细胞增殖
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